Để cùng toàn Đảng, toàn dân, toàn quân cả nước quyết tâm đánh thắng đế quốc Mỹ xâm lược. Thời kỳ này khí thế trong thanh niên cả nước rất sôi nổi:
- Ở miền Bắc, Trung ương Đoàn Thanh niên Lao động Việt Nam phát động phong trào “ Ba sẵn sàng”, đó là:
+ Sẵn sàng chiến đấu, chiến đấu dũng cảm và sẵn sàng nhập ngũ (bộ đội chủ lực, bộ đội địa phương, dân quân tự vệ);
+ Sẵn sàng khắc phục mọi khó khăn, đẩy mạnh sản xuất, công tác và học tập trong bất kỳ tình huống nào;
+ Sẵn sàng đi bất cứ nơi đâu, làm bất cứ việc gì khi Tổ quốc cần đến.
- Đồng thời ở miền Nam, dưới sự lãnh đạo của Đảng nhân dân Cách mạng miền Nam, Đoàn Thanh niên Nhân dân cách mạng cũng phát động phong trào “Năm xung phong” là:
+ Xung phong tiêu diệt thật nhiều sinh lực địch;
+ Xung phong tòng quân và tham gia du kích chiến tranh;
+ Xung phong đi dân công và thanh niên xung phong phục vụ tiền tuyến;
+ Xung phong đấu tranh chính trị và chống bắt lính;
+ Xung phong sản xuất nông nghiệp trong nông hội.
Phát huy truyền thống của thế hệ Thanh niên xung phong chống Pháp, để có lực lượng cơ động đặc biệt thường trực phục vụ bội đội chiến đấu và khi cần thiết tham gia chiến đấu, mở đường, bảo đảm giao thông phục vụ các chiến trường, được Trung ương Đảng, Chủ tịch Hồ Chí Minh và Chính phủ giao nhiệm vụ, Trung ương Đoàn phát động phong trào gia nhập Thanh niên xung phong chống Mỹ, cứu nước. Ngày 21/6/1965, Thủ tướng Chính phủ ra Chỉ thị số 71/TTg-CN về thành lập các Đội Thanh niên xung phong chống Mỹ, cứu nước.
Ngay sau đó đã có 14 vạn nam, nữ cán bộ, đội viên Thanh niên xung phong gia nhập 170 đội và 50 đại đội trực thuộc với quyết tâm “Xẻ dọc Trường Sơn đi cứu nước”, “Tất cả để đánh thắng giặc Mỹ xâm lược”. Ở miền Nam, dưới sự lãnh đạo của Đảng, từ ngày 17 - 26/3/1965, Đại hội Đoàn Thanh niên nhân dân cách mạng miền Nam lần thứ nhất đã đề ra phương hướng hoạt động cho phong trào thanh niên. Ngay sau đó ngày 20/4/1965, đơn vị Thanh niên xung phong Giải phóng miền Nam đầu tiên được thành lập, bước đầu có quân số 108 cán bộ, đội viên; tiếp tục phát triển thành Tổng đội Thanh niên xung phong Giải phóng miền Nam với quân số gần 5.000 người để phục vụ các Sư đoàn bộ đội chủ lực và làm nhiệm vụ hậu cần cho quân giải phóng ở miền Đông Nam Bộ; đồng thời thành lập các đơn vị Thanh niên xung phong tập trung với gần 5.000 người phục vụ bộ đội chủ lực ở khu, tỉnh; nhiều nơi cũng đã phát triển Thanh niên xung phong huyện, xã (Thanh niên xung phong cơ sở). Thanh niên xung phong giải phóng miền Nam đã có lực lượng hùng hậu với 4,5 vạn nam, nữ cán bộ, đội viên phục vụ ở các chiến trường.